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在封闭于乳状液薄膜中酶的反应堆中各种油包水型乳状液变化对酶反应及转变和乳状液稳定性的影响 作者： 在封闭于乳状液薄膜中酶的反应堆中各种油包水型乳状液变化对酶反应及转变和乳状液稳定性的影响 摘要 影响各种油包水型（W/O）乳状液的变量的因素，如油包水在W/O型乳状液中的的含量、乳化速度和时间、乳化剂的浓度，在一个装入乳状液薄膜种酶的（EELM）系统中L-苯基丙氨酸甲基酯(L-PME,酶反应物)和L-苯基丙氨酸 (L-Phe ，产物)是伴随着反应物的水解反应进入到产物中的。在系统中当乳化剂浓度对反应物浸透率影响很小的条件下，高的油包水比例或低的乳化能力时，其浸透率高。产物的浸透率在系统中油包水比例为1/1时最高，在最低的乳化能量或乳化剂浓度为7 wt%时最低。这是因为浸透率只取决于物质移动的阻力，如在界面处表面活性剂的阻力，薄膜的厚度以及乳状液液滴的移动区域。这解释是在乳状液液滴的大小，乳状液粘度以及内部小液滴的大小实验的标准数据的基础上。最后，最佳的浸透率是在乳化剂浓度为7wt%，油包水比例为1/1，乳化速度为6000rpm/15min的状态下。 关键词：酶乳化液体膜；水油比；乳化能；乳化剂；乳化液滴尺寸 1 导言 乳状液薄膜（ELM）是最先由李在1968年发现的，并提供了使装入薄膜的物质分开混合的有效法方法。这项技术应用于各种分离过程，包括烃的分离，污水处理，恢复和净化金属阳离子，而且应用于生物化学和生物医学领域。在生物化学的应用中，ELMs对薄膜反应的快速分离及酶的反应过程有潜在作用。这个过程是在W/O型乳状液内含酶分散在乳状液中连续进行的。这些提供非常备的生物催化剂的固定技术与乳状液反应的系统称为EELM反应堆。这些酶能容易地固定在EELM反应堆中被需要的乳状液里面，而且为能简单分裂并重复使用的乳状液。在EELM反应堆中这些液体薄膜能保护固定不动的酶免于抑制剂的作用，使进行的酶反应步骤与下游过程整合。在复杂的发酵肉汤中，一个需要的反应物能预先被薄膜正确的选择。 虽然EELM技术比其他的酶固定技术有许多的优点，但为了使EELM应用于一个实际过程仍需要解决一些问题。尤其是要求在连续操作中酶的活性与乳状液的稳定性必须保持不变。大体上，再EELM系统中薄膜的破坏和膨胀降低了乳状液的稳定性。薄膜的破坏包括乳状液的破裂从而导致酶的损失。结果破裂使得酶不能被固定在乳状液中。影响乳状液稳定性的主要因素：包括薄膜的形成，乳状液的制备方法以及乳状液与反应物状态的条件。膨胀是由于外部状态与内部状态不同的渗透压使水有外部运输到内部的现象。水的移动将（1）减少基体反应的动力。（2）使薄膜变薄，因此导致了乳状液得不稳定。（3）改变了乳状液的流变学特性，使乳状液的运输和分离现象变得更难。结果，乳状液特性的改变增加了分散的能力，使得难于连续操作。 乳状液的组成和乳状液的制备方法直接影响到酶反应的速度和乳状液的稳定性。在EELM系统中不论酶反应的类型如何，有一些操作能保持乳状液的特性：W/O型乳状液中油包水的比例，乳化速度，乳化时间和乳化剂浓度。然而对于影响EELM系统特性变量的实际应用问题方面只有很少的研究。 因此我们研究乳状液的制备条件对EELM反应堆中酶反应的速度和乳状液的稳定性的作用效果。我们阐述了对乳状液有效的结果，像乳状液液滴的大小，乳状液的粘度和内部小液滴的大小等等。L-苯基丙氨酸甲基酯由胰凝乳蛋白酶水解为L-苯基丙氨酸被选择作为EELM系统的反应模型。这些酶对于D L-苯基丙氨酸甲基酯水解为L-苯基丙氨酸又立体选择性，对外消旋混合物的光学作用有重要意义。最后，这项工作能为EELM系统提供实际酶反应的应用，并确定了制备乳状液最适宜的标准。 2 实验 2．1 实验材料 L-苯基丙氨酸甲基酯，L-苯基丙氨酸和胰凝乳蛋白酶由Sigma（美国）提供。煤油从Kanto（日本）购买,它的特别的之处是在 2．2 实验方法 用于作为EELM系统薄膜的有机溶剂，由溶解于煤油中的巴拉诺克斯100和甲基三烷基氯化铵制成。溶解了胰凝乳蛋白酶的磷酸盐缓冲液用于内部。为了制备封闭了酶的乳状液，将酶的水溶液缓慢的加入到有机溶液中并用高速均质器混合，使它形成小水滴并分散在有机溶剂中。一个反应物的溶液是使得L-苯基丙氨酸甲基酯溶解的磷酸盐缓冲液。为了进行EELM实验，制备的W/O型乳状液被分散于EELM系统外部的反应物水溶液中。EELM实验是在一个配备了四个垂直阻力的750毫升的反应物进行的，使得防止在混合反应物的水溶液和乳状液是形成旋涡。同时，恒温条件（ 在EELM系统中酶反应是L-苯基丙氨酸甲基酯在胰凝乳蛋白酶的作用下水解为L-苯基丙氨酸，如下所示： 在外部的状态的反应物 (L-PME)经过薄膜分散是根据自身的可溶性逐步进行的，当产物(L-Phe) 在运输者的帮助下分散是在它之后在内部的状态内发生的。详细的运输系统机制在我们的之前的工作中被描述。图 1 表示在EELM 系统中L-PME 和 L-Phe 的运输机制伴随的酶反应的示意图。 为了要测量酶反应的转变范围，样品定期地被从反应堆中拿出，然后外部溶液由薄膜过滤器（微孔过滤器）过滤使得与乳状液分离。在外部的溶液中L-PME 和 L-Phe 的浓缩是使用HPLC(沃特斯) μ-Bondapak C18确定的 。 用一台配有能照明显微镜的照相机(Nikon)来观察乳状液液滴。那照片是在快门速度为1/4000s时被拍摄的。除此之外，离心分析器被用来获得内部液滴大小的描述，在 薄膜破坏的范围可由内部泄漏到外部酶的数量来确定。换句话说，它可以由当新的反应物加入到外部时酶反应进行的快慢容易的估计出来。这个方法的优点是排除使用示踪器，这可能对EELM系统有影响。 为了测定的乳状液膨胀，我们拍照片来观察乳状液液滴大小的变化。乳状液的膨胀百分比是由在任何时候乳状液的粘度与最初乳状液的粘度的比来定义的并有以下关系 图 2 概述了 EELM 的全过程实验图解。表1 给出了在EELM 实验的典型实验条件。 3 结果和讨论 3．1 W/O型乳状液中油包水比例的效果 观察W/O乳状液中油包水的比例与乳剂黏度之间的关系，是为了更好地理解EELM系统。如图3（a）所示，W/O在1.0以上的范围内增加，导致了乳状液黏度以79.2s-1 的高比例增长。非常淡的乳状液（ ?o/w＜0.1） 就像简单的液体，呈现牛顿流体。在乳状液更粘稠（?o/w ＞0.5）的情况下，内部各个小液滴相互作用，形成了集合体，这些集合体呈现出黏弹性状。定义一种淡的乳状液的相对粘性，我们引用爱因斯坦提出的如下方程： 其中?i表示连续油状粘性，η表示内部液滴体积比，且假设：内部各液滴之间没有相互作用，从分散的能量或者粘滞上升到流体运动，接近液滴界面。 图3（b）显示了在油包水的最高比例上测出的乳状液相对粘性上的效果。当?i的增长超出了等式（3）的有效范围，围绕在液滴周围的弯曲的流变模式（the distorted ?o/w patterns）相互靠在一起，最终重合。因而发生的水相互作用力增加。浓的乳状液在高的剪切力作用下以致液滴完全被分散，且能用以下关系式表示： 式中k取决于液滴间水力的相互作用。将图3的数字填入方程（4），得到k的值为0.78。 在外部相位与乳状液液滴之间的物质移动区域作为最重要的因素影响底层浸透率和EELM系统中的产物。它和乳状液液滴的平均大小有密切关系，乳状液液滴的平均大小取决于与?o/w有着功能性关系的乳状液黏度。为了阐明?o/w在浸透率上的效果，有必要用Sauter mean diameter来解释物质移动，Sauter mean diameter刻画了乳状液液滴的平均大小。对于仅有不同油包水比例的两个EELM系统来说，物质移动区域，也即乳状液液滴的外部表面区域，Ae1 和 Ae2可以用Sauter mean diameter来解释，d32,1 和d32,4可以分别用以下等式来表示： 式中的N1 和N2是乳状液液滴的数量。当两个系统中的乳状液相位的体积相等，而且乳状液体积的变化，比如乳状液膨胀可以忽略之时，乳状液体积可以用（7）式表达： 根据等式（5）和等式（7）可得出以下关系： 因此，两个物质移动之间的比率与Sauter mean diameter之间的比率成反比。图4给出了在乳状液液滴大小分布上的效果。表2给出了内部相位液滴和乳状液液滴的Sauter mean diameter，还给出了在所有实验条件下乳状液的膨胀百分比。如图4和表2所示，总体上，一个更高的?o/w引起了一个更大的乳状液液滴和更广的分布，因而带来了一个更小的移动区域。 图5显示了，随着时间变化，外部相位L-苯基丙氨酸甲基酯（反应物） 和 L-苯基丙氨酸（产物）在正常浓度下变化的效果。L-苯基丙氨酸甲基酯（反应物） 和 L-苯基丙氨酸（产物）被分别定义为在任何时候水解成原始底层浓度的反应物的比例和产物的浓度。外部相位的底层浓度随着时间的变化而以较高的?o/w减少，因运输到内部相位的基体很快就耗尽了。因为大量的酶聚集在内部相位，以致于内外部相位之间的基体浓度坡度较大。这意味着底层浸透率很大程度上取决于作为底层接收器的大量酶，而非乳状液液滴与外部相位间的外部表面区域。通常，通过薄膜的扩散阻力的减小同?o/w是由于当外部的表面区域减少的时候的减少。最后，我们可以注意与之相反的在浸透之上的效果导致了产品的最高浸透率在?o/w为1/1, 如图 5 所示. 内部小液滴大小在?o/w上的分布状态如图6所示，指出内部小液滴的平均大小随着?o/w的增加而增加，如表2种描述。然而，众所周知内部小液滴平均大小的不同通常对溶质的浸透率有很小的影响，因为它们的大小和?o/w是独立的，因此物质通过薄膜和内部界面时的阻力与其他的阻力相比是可以忽略不计的。 3．2 乳化速度和乳化时间的作用 在乳化过程中输入的能量取决于乳化的速度和时间。我们研究了他们对内部反应物和产物浓度变化的作用。图7说明了要输入到系统中的能量更大取决于更快的乳化速度和更长的搅拌时间，而且反应物和产物的浸透率要更低。这个结果能归因于负担更高的乳化剪切能量使得酶的活性降低，乳状液液滴外表面区域的减小由乳状液液滴大小的减小造成，如图8中所示。乳状液内部液滴大小的减小的原因能用系列各项解释。 比较高的乳化能量使得内部小液滴的大小更小，如图9所示。在一个给定的薄膜内乳化剂浓度的条件下当内部小液滴比较小时，乳化剂被分散通过一个更大的内部与乳状液的界面，这个界面减小了外部与乳状液界面的表面活性剂阻碍的密度，造成了适合减小的表面张力。最后，当搅拌器的速度保持不变时外部表面区域将减小是由于乳状液有比较高的表面张力。 在 EELM 系统乳状液膨胀是因为乳状液在较高的乳化速度和较长的乳化时间条件下制备（见表2）。这是由产物从内部到外部的浸透率降低造成的。换句话说，产物从内部释放的更少并堆积在那里造成了通过薄膜的渗透压增加。 3．3 乳化剂浓度的作用 图 10所示，反应物和产物渗透压的变化随着在薄膜中作为乳化剂巴拉诺克斯100 浓度的变化，这定义了在百分比的基础上巴拉诺克斯100的溶解率。 基体和产物的浸透率在乳化剂浓度为 5 wt%是非常高的，如图10所示。这个结果能归因于乳状液的破坏。破坏是定义为在120分钟内分离外部和乳状液时反应物到外部的数量。然后L-PME和L-Phe在5 wt%的乳化剂浓度下浓缩仅用了很短的时间，这是因为内部大部分的胰凝乳蛋白酶泄漏到外部。如此的实例被涂11阐明得很好，它给出了乳化剂浓度对于内部小液滴分布的影响。图11说明了内部小液滴大小的分布几乎取决于薄膜内部乳化剂最初的浓度。由这个论据，我们能注意到在薄膜和内部的界面的乳化剂几乎同所有的乳化剂最初的浓度相同。同时，在外部与乳状液液滴的界面的乳化剂密度在一个较低的乳化剂浓度条件下被假设变小，形成了暂时性的双重水包油包水型乳状液。最后，在乳化剂浓度为5wt%情况下，认为在界面处乳化剂最小的密度可以引起乳状液的不稳定性。 产物在乳化剂浓度为10wt%的浸透率低于在7wt%时，如图10所示，这能归于两个原因。首先，乳状液液滴的平均大小比较高是由于在高的乳化剂浓度时粘度较高，如图12所示。平均大小的增大引起了物质移动区域的减小。第二，高的乳化剂浓度引起了反应物在界面处更大的移动阻力。 在乳化剂浓度为7-10wt%之间时反应物的浸透率几乎是相同的，正如图10中所示。它能被假设为由乳化剂形成的相反的胶囊在较高的乳化剂浓度下对反应物的运输有利。在乳化剂浓度为10wt%时，这些作用由反应物的浸透率降低引起的乳状液液滴大小增大以及界面阻力的升高所抵消。 4 结论 在一个 EELM 反应堆中W/O型乳状液制备的变量对反应物(L-PME)和产物 (L-Phe) 浸透的作用是在详尽的乳状液数据的帮助下被认知的，像乳状液液滴的大小、乳状液粘度、W/O型乳状液内部小液滴状态。反应物在胰凝乳蛋白酶催化下水解生成产物被选作为EELM系统的反应模型。乳状液的制备数据包括W/O型乳状液中油包水的比例，乳化速度，乳化时间以及乳化剂的浓度。 在较高的?o/w时反应物的浸透率比较高，这是因为它在很大程度上依赖于内部酶的数量。另一方面，产物到外部的浸透率在?o/w为1/1时最高。这被归因于产物的渗透上的两个相反的作用，薄膜厚度的增加以及随着?o/w减小乳状液液滴大小的减小。我们也可以得出结论在 EELM 反应堆中产物的渗透几乎由乳状液分散所控制而不受内在小液滴大小的控制。 当输入EELM 系统中较高的乳化能力时，反应物和产物的浸透率都降低。高的乳化能力引起外部与乳状液液滴的界面处表面活性剂浓度的降低，从而形成了更小的内部小液滴。最后，大的乳状液液滴的形成减小了乳状液的外部表面积。同时，在高的乳化能力时膨胀是不能忽略的，因为产物的浸透率在较高的能量下较低。 5wt%的乳化剂浓度引起了乳状液的不稳定性。同时，在10wt%的乳化剂浓度时产物的浸透率最低因为乳状液液滴的增大以及较厚的表面活性剂层在界面处形成。最后，得到最佳的乳化剂浓度为7wt%。 |
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