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从豆腐渣中果胶多聚糖的提取和精制和对它们的结构的酶的分析 作者： 从豆腐渣中果胶多聚糖的提取和精制和对它们的结构的酶的分析 果胶多聚糖(6.74g)是用六偏磷酸钠溶液从豆腐渣中(豆腐副产品，30g)提取出来的。提取物由DEAE纤维素色谱法被分离成微量的半乳糖醛酸酯和丰富的半乳糖醛酸酯片断。其多聚糖片段被完全地降解成三种果胶酶和两种半纤维素酶，即外切多聚半乳糖醛酸酶和内切多聚半乳糖醛酸酶,外切多聚半乳糖醛酸裂解酶、外切半乳糖醛酸酶和外切阿拉伯糖酶。降解极限的结果表明了大豆果胶多聚糖由半乳糖醛酸酯区域和鼠李聚糖半乳糖醛酸区域运载的支链所组成，主要是同类的阿拉伯聚糖和半乳聚糖。半乳糖醛酸酯区域被分布在还原和未被还原的多聚糖的末端。版权--1996年Elsevier科学有限公司 介绍 豆腐渣(豆腐副产品)是从大豆中提取出油和蛋白质以后的残渣。豆腐渣含有丰富的膳食纤维，特别是果胶的多聚糖(Higashira & Misaki,1988),它们与柑橘类植物果胶不同，因为豆腐渣果胶的多聚糖包含很多不确定的糖。这些果胶的多聚糖构成和序列已经被报导(Aspinall 等, 1967; Kawamura 1967 年; Kikuchi & Sugimoto, 1976), 但他们结构的许多方面还很难懂。 果胶的多聚糖通常由两个截然不同的区域组成，线性半乳糖区(GN)和支链半乳糖区(RG)(Barrett & Notrhcote 等，1965年；De Vries 等,1986年；McCleary & Matheson 1986年；Matsuhashi 等，1989年,1993)。RG区域的支链主要由阿拉伯糖-4-半乳糖苷键组成,它们依次由被部分阿拉伯糖或者阿拉伯低聚糖取代的β-1，4-D-半乳糖苷键组成 (Dekker & Richardson, 1976年)。在果胶酶分子学里GN区域数量和分布状态的判定,和阿拉伯糖-4-半乳糖苷键已经用酶HPLC法被检验了 (Matsuhashi等，1989年；Emi等，1971年；Labavitchi等，1976年；De Vries等,1983年；Nakano等，1985年；Yamaguchi等,1995年)。相反大豆多聚糖GN区域的结构从未被检验除了内切-β-D-半乳糖苷键降解极限的研究(Emi 等，1971年；Labavitchi等，1976年；Yamaguchi等,1995年) 我们开始了对大豆果胶的多聚糖的研究为了发现它们最佳潜在的用途。在当今的工作中, 我们检验了豆腐渣中果胶多聚糖的提取和精制，估算了GN区域的数量和分布状态和支链的酶HPLC法。 材料和方法 实验材料 干燥的豆腐渣(豆花)由Misuzu豆腐有限公司提供(长野,日本)。 柑橘果胶中的酸性不溶果胶酸酯(AIP)被用作多聚半乳糖醛酸(Hatanaka & Ozawa, 1966年)。 阿拉伯-3,6-半乳聚糖(阿拉伯半乳聚糖,落叶松植物木头)由ICN有限公司提供。 甜菜阿拉伯聚糖(Tagawa & Kaji,1969年),玉米阿拉伯树胶酸对苄苯基甲酰胺(玉米阿拉伯树胶酸对苄苯基甲酰胺，Yamaguchi & Hatanaka,1993年)和柑橘果皮中被交互相联的细胞壁(CLCW) (Hatanaka等，1990年)作为早先描述。 其它化学制品(试剂等级)由Nacalai Tesque (京都, 日本)供应。 酶 外切多聚半乳糖醛酸(外切-PG区域)和内切多聚半乳糖醛酸(内切-PG区域)分别从红萝卜根中(Hatanaka & Ozawa,1964年)和脆壁克鲁维酵的培养液中(Inoue 等，1984年)中精制而得。外切多聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL)从软腐欧文氏杆菌的培养液中精制而得。软腐亚菌IF0 13921 由Kegoya 等人的方法制备(1984) 。崩溃酶溶液(Kyowa Hakkou Kogyo Co., 东京, 日本) 曾经被Matsuhashi 等人(1992)描述过。纤维素酶 (从曲霉菌中制备) 由Amano药品有限公司提供(名古屋, 日本, Yamaguchi 等, 1995). 果胶的多聚糖的提取 提取的效率被检验由替换相当数量干豆腐渣, 从5 到 DEAE 纤维素色谱法 NaCl 在磷酸盐缓冲中的线性梯度 (Hatanaka & Ozawa, 1968) 未加工的样品(400mL, 0.05% 溶液) 加入到DEAE 纤维素柱状物中(3 x 总糖和醛糖的分数含量分别用苯酚硫酸法(Dubois 等1956)和咔唑法(Galambos 1967)分析。记录下每种糖的最高分数含量,连续地用蒸馏水和去离子水渗析,然后用2体积的酒精混合。离心过滤后收集的沉淀物连续的用70%酒精，99%酒精和丙酮洗涤 ，然后风干。 酸碱梯度(9.0 -11.0) 的碳酸盐缓冲液(Hatanaka & Ozawa, 1966) 未加工样品加入到DEAE 纤维素柱状物中用 蛋白质含量 蛋白质含量由Lowry 的方法已测定（1951）。 大豆的分子量发行的估计果胶的多聚糖 分子量分布依据凝胶体滤清被估计。操作条件是如下: 柱状物, Asahipak GS-710 (7.6 x 中性糖和半乳糖醛酸酯的测量 中性糖和半乳糖醛酸酯含量由Matsuhashi 等人的(1992)酶-HPLC法计算。反应混合物包含0.1%试料溶液, 0.1%甘油(国内标准), 崩溃酶溶液(0.5 ml/ml)和 (6 x 中立糖的结构被测量如下: 样品在 酶化验 多聚糖分解的活动由还原糖产生的量，被修改过的Somogyi方法(Hatanaka & Kobara,1980)计算 。 标准化验反应发生在 大豆多聚糖分离(SP)降解的酶(Yamaguchi等1995年) 纤维素酶混合物Amano 3( toyopearl的 酶的部份洗净 Fl酶 一种外切类型的半乳糖醛酸酯在Fl片段里被净化如下: NaCl被增加了Fl片段到 F2酶 一种外切类型的阿拉伯树胶酸在F2片段里被净化用CLCW色谱法和胶凝体过滤如Fl片段所描述。 酶分子量的计算(Audrews,1965年) 酶分子量利用Sephacryl S-200管柱由胶凝体过滤估算。磷酸化酶(94,000), 牛血清蛋白(68,000), 卵清蛋白 (45,000) 和chymotripsinogen (27,500)被作为标准使用。 半纤维素酶的水解产物的HPLC分析 反应混合物(总体积1.0 mL) 包含0.5%大豆多聚糖,0.1%丙三醇(HPLC的国内标准),酶制剂制备,和 果胶多聚糖胶质的降解极限的HPLC 测量法 果胶的多聚糖果胶酶的降解极限由Matsuhashi等人的方法测量。(1989,1993) 。 反应混合物包含C-APS2 (0.05%), 丙三醇(O.l%, HPLC国内标准),醋酸钠缓冲液( 结果和讨论 从豆腐渣中果胶多聚糖的提取 图1 显示在每种萃取物中的醛糖和蛋白质浓度(A280)。在 在结果被描述的基础上，果胶多聚糖( 大豆果胶的多聚糖的净化 阴离子交换色谱法在碱性情况下是有名的为分离果胶的多聚糖的方法, 但这个方法不能应用在果胶上因为碱性脱脂作用β消除分裂半乳糖醛酸酯骨架(Hatanaka & Ozawa,1966)。然而,我们在这个工作中使用了碱性或酸性缓冲液的DEAE纤维素色谱法。 DEAE纤维素色谱法得到的磷酸盐缓冲液见图2(A)。大豆果胶多聚糖被分离成一个中性多聚糖片段(P-NPS)和两个酸性多聚糖片段, 用梯度洗提P-APSl和用NaOH溶液洗提P-APS2。这三个片段的产量分别是20.2 mg,198.3 mg和42.7mg。 DEAE纤维素色谱法用碳酸盐缓冲液进行见图2(B)。果胶的多聚糖也分成三个片段, C-NPS 、C-APSl和C-APS2 。在这种情况下,然而,当NaOH溶剂被使用时没有糖最大量被观测。三个片段的产量分别是17.0mg,91.0mg和92.0mg。 每个多聚糖的产量，蛋白质的含量和糖的结构见表1所示。蛋白质含量被DEAE纤维素色谱法大大地减少。醛糖含量由量热颇法获得,例如咔唑法(Galambos,1967)和m-氢氧根法(Blumenkrantz & Asboe-Hansen,1973), 在产量上被估计比那些用酶-HPLC法(Matsuhashi & Hatanaka,1992)分析更高。在这个试验中, 我们使用了既简单又准确的酶-HPLC法。在这个方法中那些被用作胶质降解的Drisalase在24 h熟化以后（日期未作显示）完全地被水解成单元单位。 如果DEAE 纤维素色谱法使用碳酸盐缓冲液, 大多半乳糖醛酸酯残滓在C-APS2 片段里被洗提。在多聚糖片段里HPLC分析显示了所有的醛糖成分是半乳糖醛酸酯。(数据未被显示,Yamaguchi & Hatanaka,1993)。 表2显示了果胶多聚糖片段的中性糖结构；在每个片段里，半乳糖和树胶醛醣是主要的成分。木糖和葡萄糖的片段不同于彼此,但是在其它糖的成分之间有接近的类同之处。 每个片段的胶凝体过滤模式见图3所示.在C-NPS低分子质量成分被提，在C-APSl 和C-APS2里那些未加工样品的主要成分的高分子质量组分被发现。C-APSl和C-APS2主要成分的分子量被估算为大约500,000。 SP降解半纤维素酶的部份洗净 为了检验半乳糖和树胶醛醣的分布,它们的多聚糖的主要成分,我们部份地净化外切类型的半纤维素酶。洗净的结果被总结在表3所示。在最后阶段的Fl和F2 的酶制剂准备大约分别净化了73.9折和 1377折在天然酶制剂之上。通过凝胶体筛选Fl和F2分子量被估计大约是75,000 和55,000。Fl和F2相对于大豆多聚糖的最大活动分别地反应在酸碱度4.0和4.5。 Fl和F2的特征培养基见表4。Fl能够降解所有的被检验的多聚糖, 并且F2的降解活动与阿拉伯树胶酸和玉米阿拉伯糖基木糖相反。结果表明F2 是一种高度被净化的阿拉伯树胶酸。 酶活力 未加工样品的水解产物由HPLC法的分析结果见图4 。不考虑反应时间从未加工样品中仅仅半乳糖醛酸酯和半乳糖用Fl分解。这些结果表明Fl有外切多聚半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶活性相反于未加工样品。F2分解树胶醛醣和HPLC 反应显示了一个以大约7.5 分钟的保留时间的峰顶。然而溶液在7.5 分钟内洗提不能改变苯酚硫酸反应的颜色,标志着它不是碳水化合物。此外，半乳糖醛酸酯，半乳糖和树胶醛醣(高峰值)被Fl和F2的化合物分解。 外切类型的C-APS和C-APS2的降解极限 表5显示了由Fl、F2和F1和F2的化合物酶解的C-APS1和C-APS2降解极限的结果。这些酶可降解每种中性糖的50～90%。用F1和F2降解的中性糖数量的总和等于由Fl 和F2的化合物降解的总数量。从净化的大豆果胶多聚糖中仅仅半乳糖和树胶醛糖用外切半乳糖醛酸酶和外切树胶醛糖酶被分解。从数据看,它能够推断出大豆果胶多聚糖的侧链由同类的聚合体组成。而且Fl从C-APS2中降解了半乳糖醛酸酯的3 1.2%。上述结果肯定了与相对于C-APS2获得利用净化外切PG区域的结果十分接近(表6) 。 在C-APS2中GN地区的分布 大多多聚糖的半乳糖醛酸酯残滓是在C-APS2片段里。因此，我们在C-APS2里检验了半乳糖醛酸酯的分布区域来估计由估计果胶酶降解极限的数值。 表6显示了几种果胶酶CAPS2的降解程度。大豆多聚糖被果胶酶降解。C-APS2的敏感性提出把半乳糖醛酸残渣的一部分放在一个线性直链的分子末端。只用外切PG区域的C-APS2的降解极限顺序比用由外切PG区域和外切PGL区域的混合物的C-APS2降解极限要低。结果提出两个半乳糖醛酸的存在减少和未减少C-APS2的分子末端。用外切PGL的降解程度别外切PG和内切PG的化合物高5.0%。这个结果显示没有半乳糖醛酸区域提出两个RG区域之间存在于分子量里(图5)。外切和内切混合物的数量哪个应该最高,然而,比只用外切PGL区域获得的要低。未被怀疑的结果可能是一个结构障碍, 它导致了C-APS2的中性糖侧链不同于酶的活性。 结论 大豆包含阿拉伯树胶酸和果胶多聚糖作为他们细胞壁的主要组分。 Aspinall等(1967)在去除蛋白质以后在85～90℃用2% EDTA二钠盐提取多聚糖, 用DEAE 纤维素色谱法使用磷酸盐缓冲液净化。在这个报告中,我们用2%的六偏磷酸钠溶液提取多聚糖,多聚糖用DEAE纤维素色谱法使用碳酸盐缓冲液净化。用先前的色谱法作为一个峰值被洗提的果胶多聚糖用我们的方法被分离成2个峰值,使它比先前完成的更进一步的做好净化准备。 虽然大豆多聚糖的部份序列已经被报告,它的整体分子结构未被描述(Aspinall 1967; Kawamura 1967; Kikuchi & Sugimoto, 1976)。一般,果胶多聚糖由最高被占用分子轨道半乳糖醛酸酯组成(中性糖的平滑区域和杂交区域和那些位于半乳糖醛酸酯的半乳糖醛酸区域(多毛区域)(De Vries,1986;Matsuhashi等,1993) 。但是Matsuura 等(1973)已经报道了云豆果胶多聚糖用多聚半乳糖醛酸酶仅被降解了很小的程度,表明它包含了很少的半乳糖醛酸酯。假如侧链, 它只被报道它由同类的内切-β-D-半乳糖醛酸酶降解极限的半乳糖体 (Emi 等1971; Labavitchi 等1976; De Vries 等, 1983，1985; Yamaguchi 等, 1995) 。所以我们利用了三种类型的果胶酶和二种类型的纤维素酶检查结构。降解极限的数值显示了大豆果胶的多聚糖包含半乳糖醛酸酯区域和鼠李半乳糖苷酸区域, 并且半乳糖醛酸酯区域被分布在两个还原和未还原的分子末端。另外,从鼠李半乳糖苷酸区域的侧链分支主要由类同的阿拉伯糖和半乳糖体组成。 |
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